HPLC (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) là gì?
Tóm lược lịch sử và một số khái niệm
Sắc ký lỏng (LC) được định nghĩa vào đầu những năm 1900 trong công trình của nhà thực vật học người Nga, Mikhail S. Tswett. Công trình tiên phong của ông chú trọng vào việc tách các hợp chất (bột lá cây), chiết từ thực vật, trong cột nhồi.
Tswett nhồi cột thủy tinh với các tiểu phân. Hai vật liệu cụ thể mà ông thấy hữu dụng là bột đá phấn (CaCO3) và alumina. Ông rót mẫu (dịch chiết từ lá cây đã được đồng nhất) vào cột và cho nó chảy qua lớp vật chất. Sau đó, dung môi tinh khiết được thêm vào. Mẫu sẽ chảy qua cột dưới tác dụng của trọng lực, các dải màu khác nhau sẽ tách ra khỏi nhau vì một số chất sẽ di chuyển nhanh hơn các chất khác. Ông liên kết các sự tách này, các dải màu khác nhau của các chất khác nhau có trong mẫu. Ông đã sáng tạo ra phương pháp phân tích nhằm tách các chất dựa trên tương tác với hạt nhồi. Những chất “dính” với hạt nhồi mạnh hơn sẽ di chuyển chậm hơn, những chất “dính” dung môi mạnh hơn sẽ di chuyển nhanh hơn. Quy trình có thể mô tả như sau: các chất trong mẫu sẽ được phân bố khác nhau giữa dung môi di chuyển (pha động) và hạt nhồi (pha tĩnh). Điều này gây nên tốc độ di chuyển khác nhau của từng chất, từ đó tách được các chất.
Tswett đặt tên là sắc ký (từ tiếng Hy Lạp chroma (màu) và graph (ghi lại), ghi lại màu) để mô tả thí nghiệm nhiều màu sắc của mình. Ngày nay, sắc ký lỏng, với nhiều hình thức khác nhau, trở thành một trong những công cụ mạnh mẽ nhất trong hóa phân tích.

Hình A. Thí nghiệm của Tswett

Kỹ thuật sắc ký lỏng (LC)
Sắc ký lỏng có thể thực hiện trên bản phẳng (kỹ thuật 1 và 2) hoặc cột (kỹ thuật 3). Sắc ký cột là kỹ thuật mạnh mẽ nhất và dung lượng mẫu lớn nhất. Trong tất cả các trường hợp, mẫu phải được hòa tan trong chất lỏng và sau đó được chuyển lên các thiết bị sắc ký.
Kỹ thuật 1. Mẫu được chấm, sau đó chảy qua một lớp mỏng vật liệu sắc ký (pha tĩnh) được cố định trên bề mặt một hộp thủy tinh (hình B). Đáy hộp thủy tinh có chứa dung môi. Động lực ở đây được tạo ra bởi mao quản, ở đây là dung môi (pha động) khuếch tán tới lớp vật liệu khô và di chuyển lên trên. Kỹ thuật này được gọi là sắc ký bản mỏng (TLC).

Hình B. Sắc ký bản mỏng

Mẫu màu đen là hỗn hợp màu thực phẩm (vàng, đỏ và xanh) đã được tách bằng sắc ký.

Kỹ thuật 2. Trong hình C, mẫu được chấm lên giấy (pha tĩnh). Dung môi (pha động) được thêm vào giữa điểm chấm mẫu để tạo dòng chảy xuyên tâm. Đây là một dạng của sắc ký giấy (Sắc ký giấy cổ điển được thực hiện tương tự như TLC với dòng chảy thẳng). Trong hình trên, hỗn hợp màu thực phẩm được đưa lên giấy.

Hình C. Sắc ký giấy

Lưu ý về sự khác nhau về hiệu lực tách trong sắc ký giấy so với bản TLC. Vòng màu xanh lá cho thấy giấy không thể tách hỗn hợp màu vàng và màu xanh lam, nhưng nó có thể tách những màu này ra khỏi màu đỏ. Ở hình dưới, mẫu xanh lá, kết hợp từ màu vàng và màu xanh lam, được đưa lên giấy. Như đã dự đoán, giấy không thể tách hai màu này. Ở hình giữa, mẫu màu tím, kết hợp từ màu đỏ và màu xanh, được đưa lên giấy. Chúng tách tốt khỏi nhau.

Kỹ thuật 3. Trong trường hợp này, cách tiếp cận mạnh mẽ nhất, mẫu được cho chảy qua cột hoặc thiết bị dạng ống có chứa tiểu phân phù hợp (pha tĩnh). Những tiểu phân này được gọi là vật liệu nhồi sắc ký. Dung môi (pha động) chảy qua thiết bị. Trong chiết pha rắn (SPE), mẫu được nạp vào cột và dòng dung môi chuyển mẫu qua thiết bị. Tương tự thí nghiệm của Tswett, các hợp chất có trong mẫu được tách bởi tốc độ di chuyển khác nhau trong cột. Ở đây, mẫu đen được nạp vào cột. Các dung môi khác nhau được sử dụng trong từng bước để hình thành quá trình phân tách.

Hình D-1. Sắc ký cột – Chiết pha rắn (SPE)

Khi dạng cột được sử dụng, có nhiều cách để tạo dòng chảy. Trọng lực hoặc chân không được sử dụng cho cột được thiết kế không nhằm để chịu áp suất. Thông thường, hạt nhồi trong những trường hợp này có đường kính lớn (> 50 µm) để ít bị cản trở dòng chảy. Cột thủy tinh hở (thí nghiệm của Tswett) là ví dụ cho loại này. Ngoài ra, cột nhựa nhỏ, thường dưới dạng ống xilanh, được nhồi bằng hạt vật liệu nhồi và được sử dụng trong xử lý mẫu. Quá trình này gọi là chiết pha rắn. Ở đây, thiết bị sắc ký ở đây gọi là cột chiết pha rắn, được sử dụng, với dòng chảy được hỗ trợ bởi chân không, để làm sạch những mẫu rất phức tạp trước khi phân tích.

Những hạt nhỏ hơn (< 10 µm) cần thiết để tăng hiệu quả phân tách. Tuy nhiên, hạt nhỏ gây việc chảy qua khó khăn hơn, vì vậy cần áp suất cao để tạo tốc độ dòng dung môi mong muốn. Bơm và cột phải chịu được áp suất cao. Khi dùng áp suất cao để tạo dòng chảy qua cột sắc ký, kỹ thuật này gọi là HPLC.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography – HPLC) là gì?

HPLC, được đặt ra bởi cố GS. Csaba Horváth trong báo cáo Pittcon năm 1970, ban đầu được đặt ra để chỉ áp suất cao được sử dụng để tạo dòng dung môi cho sắc ký lỏng trong cột nhồi. Ban đầu, bơm chỉ tạo được áp suất tối đa là 500 psi (35 bar). Kỹ thuật này gọi là sắc ký lỏng áp suất cao (high pressure liquid chromatography), hay HPLC. Vào đầu những năm 70 đã chứng kiến bước nhảy mạnh mẽ trong công nghệ. Các thiết bị HPLC đời mới cho phép chịu áp suất lên tới 6000 psi (400 bar), đi kèm với cải tiến hệ thống tiêm mẫu, đầu dò và cột. HPLC bắt đầu nắm phần lớn vào giữa và cuối những năm 70. Với sự nâng cao liên tục về hiệu năng trong thời gian này (hạt nhỏ hơn, áp suất chịu được cao hơn), từ viết tắt HPLC được giữ lại, nhưng tên được đổi thành sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography).

Sắc ký lỏng hiệu năng cao hiện nay là một trong những công cụ mạnh mẽ nhất trong hóa học phân tích. Nó có khả năng phân tách, xác định và định lượng các hợp chất có trong mẫu có thể hòa tan trong dung môi lỏng. Ngày nay, các hợp chất ở nồng độ vết cỡ ppt có thể dễ dàng được phát hiện. HPLC có thể, và đã được áp dụng với bất kỳ loại mẫu nào, ví dụ như dược phẩm, thực phẩm, dinh dưỡng, mỹ phẩm, nền mẫu môi trường, mẫu hình sự và hóa chất công nghiệp.

Hình D-2. Cột HPLC

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performance Liquid Chromatography – UPLC) là gì?

Vào năm 2004, với sự tiến bộ của thiết bị và công nghệ cột, đã có sự tăng vượt bậc trong độ phân giải, tốc độ và độ nhạy của sắc ký lỏng. Cột sử dụng hạt nhồi có kích thước nhỏ hơn (1,7 µm) và thiết bị có khả năng vận chuyển pha động tại áp suất 15 000 psi (1000 bar) là cần thiết để đạt hiệu năng cao hơn. Một hệ thống mới được xây dựng để thực hiện sắc ký lỏng siêu hiệu năng, nay được biết tới là công nghệ UPLC.

Các nghiên cứu cơ bản được thực hiện hiện nay bởi các nhà khoa học đều sử dụng cột có hạt nhồi có đường kính nhỏ hơn 1 µm và áp suất tối đa là 100 000 psi (6800 bar). Điều này giúp chúng ta có sự mong đợi vào các tiến bộ trong tương lai.