Sắc ký lỏng hiệu năng cao hoạt động như thế nào?

Các thành phần của hệ HPLC cơ bản được thể hiện ở hình E.

Bình chứa đựng dung môi (pha động, vì nó di chuyển). Bơm cao áp (bộ vận chuyển dung môi hay bộ quản lý dung môi) được sử dụng để tạo và đo tốc độ dòng pha động, thường là mL/phút. Bộ phận tiêm mẫu (bộ quản lý mẫu hay bộ tiêm mẫu tự động) có tác dụng đưa (tiêm) mẫu vào dòng chảy của pha động để vào cột HPLC. Cột phải chứa vật liệu nhồi sắc ký để quá trình tách được hiệu quả. Vật liệu nhồi này được gọi là pha tĩnh, vì nó được giữ cố định bởi phần cứng của cột. Đầu dò có tác dụng phát hiện các dải chất khi chúng được rửa giải khỏi cột HPLC (phần lớn các hợp chất đều không có màu nên không quan sát được bằng mắt thường). Pha động rời đầu dò và tới bình thải, hoặc thu gom lại tùy nhu cầu. Pha động chứa các dải chất phân tích, HPLC cung cấp khả năng thu theo các phân đoạn rửa giải chứa các hợp chất đã được làm sạch. Đây gọi là sắc ký điều chế.

Lưu ý rằng các hệ thống đường ống, mối nối để nối bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột và các thành phần đầu dò để tạo đường cho pha động, mẫu và các dải chất đã được phân tách.

Hình E. Hệ thống HPLC

Đầu dò được kết nối với máy tính, bộ phận ghi lại tín hiệu điện để ghi sắc ký đồ trên màn hình nhằm có thể phân tích định tính cũng như định lượng các thành phần có trong mẫu (hình F). Vì tính chất khác nhau của các chất mà có nhiều loại đầu dò khác nhau. Ví dụ, nếu chất đó có khả năng hấp thụ tử ngoại, đầu dò hấp thụ UV được sử dụng. Nếu chất đó có khả năng phát huỳnh quang, đầu dò huỳnh quang được sử dụng. Nếu chất đó không có những tính chất trên, đầu dò vạn năng hơn sẽ được sử dụng, ví dụ như đầu dò tán xạ bay hơi (ELSD). Hướng tiếp cận mạnh mẽ nhất là sử dụng kết hợp nhiều đầu dò. Ví dụ, đầu dò UV và/hoặc đầu dò ELSD có thể kết hợp với thiết bị khối phổ để phân tích kết quả tách sắc ký. Điều này giúp thu được nhiều thông tin hơn của chất phân tích. Sự ghép nối hệ thống khối phổ với hệ HPLC  gọi là LC/MS.

Hình F: Hệ thống HPLC điển hình (Waters Alliance)

Quá trình tách trong HPLC

Cách đơn giản để hiểu quá trình tách các chất trong mẫu thể hiện ở hình G.

Pha động vào cột từ bên trái, di chuyển qua lớp hạt nhồi và ra ở phía bên phải. Hướng dòng chảy thể hiện ở mũi tên xanh. Đầu tiên, tại thời điểm ban đầu (lúc bắt đầu tiêm mẫu), mẫu sẽ đi vào cột và bắt đầu tạo dải. Mẫu ở đây là hỗn hợp thuốc nhuộm vàng, đỏ và xanh, xuất hiện ở đầu vào cột dưới dạng một dải đơn màu đen (Trong thực tế, mẫu có thể là bất kỳ có thể hòa tan trong dung môi, thường là không màu và thành cột mờ, vì vật chúng ta cần đầu dò để phát hiện các chất đã được tách khi chúng được rửa giải.)

Sau vài phút, trong khi pha động liên tục chảy và qua cột với tốc độ không đổi, chúng ta có thể thấy các dải màu di chuyển thành từng dải riêng biệt với tốc độ khác nhau. Đây là do có sự cạnh tranh giữa pha động và pha tĩnh về ái lực với từng phẩm màu hay còn gọi là chất phân tích. Dải màu vàng di chuyển nhanh nhất và chuẩn bị rời cột. Phẩm màu vàng dường như có ái lực hơn với pha động so với các phẩm màu khác. Vì vậy, nó di chuyển nhanh hơn, gần với tốc độ pha động. Dải màu xanh có ái lực với vật liệu nhồi hơn so với pha động. Ái lực mạnh so với hạt nhồi khiến nó di chuyển chậm hơn đáng kể. Nói cách khác, đây là chất bị lưu giữ mạnh nhất trong hỗn hợp. Dải màu đỏ có ái lực trung bình so với pha động nên di chuyển với tốc độ trung bình qua cột. Với các dải màu di chuyển với tốc độ khác nhau, chúng ta đã có thể tách các chất bằng sắc ký.

Hình G: Cách thức hoạt động của cột sắc ký

Đầu dò là gì?

Khi các dải màu, sau khi tách riêng biệt, rời cột, chúng sẽ đến đầu dò. Đầu dò sẽ có flow cell giúp phát hiện các chất riêng biệt các chất riêng rẽ so với nền của pha động, thể hiện ở hình H (Trong thực tế, dung dịch của các chất ở mức nồng độ để chạy HPLC thường không màu). Đầu dò phù hợp có khả năng “cảm nhận” các chất có trong mẫu và chuyển thành tín hiệu điện gửi sang máy tính. Tùy thuộc vào tính chất, nồng độ chất cần tách và phân tách mà lựa chọn đầu dò phù hợp.

Sắc ký đồ là gì?

Sắc ký đồ là hình ảnh thể hiện các quá trình hóa học (quá trình tách sắc ký) diễn ra trong hệ HPLC. Các peak nâng lên từ đường nền được vẽ trên trục thời gian. Mỗi peak thể hiện sự phản hồi của detector với từng chất. Sắc ký đồ được vẽ trên máy tính (hình H).

Hình H. Cách tạo thành peak

Ở hình H, dải màu vàng đã hoàn toàn khỏi flow cell của detector; tín hiệu điện sinh ra được gửi tới máy tính. Sắc ký đồ bắt đầu xuất hiện trên màn hình. Lưu ý rằng sắc ký đồ bắt đầu được vẽ khi mẫu bắt đầu được tiêm và thể hiện dạng đường thẳng gần sát cạnh dưới màn hình. Đây gọi là đường nền, thể hiện pha động chảy qua cột đi qua flow cell theo thời gian. Khi dải chất màu vàng đi qua flow cell, tín hiệu mạnh hơn sẽ được gửi tới máy tính. Đường sắc ký đồ sẽ đi lên, rồi đi xuống, tỷ lệ với nồng độ dải vàng trong dải mẫu. Quá trình này tạo peak trên sắc ký đồ. Sau khi dải màu vàng hoàn toàn rời cell đầu dò, tín hiệu quay lại mức đường nền; một lần nữa, chỉ có pha động trong flow cell. Vì dải màu vàng di chuyển nhanh nhất, bị rửa giải đầu tiên khỏi cột, nên nó là peak đầu tiên được vẽ.

Một lúc sau, dải màu đỏ đến flow cell. Tín hiệu lại tăng từ đường nền khi dải màu đỏ vào trong cell, và peak thể hiện dải đỏ bắt đầu được vẽ. Trong hình này, dải đỏ chưa hoàn toàn đi qua flow cell. Hình vẽ thể hiện dải màu đỏ và peak màu đỏ khi được hoàn thiện (nét đứt). Dải màu xanh, chất bị lưu giữ nhất sẽ di chuyển với tốc độ chậm nhất và được rửa giải sau dải màu đỏ, Đường nét đứt thể hiện sắc ký đồ nếu tiếp tục cho đến hết. Khá thú vị là peak xanh có bề rộng lớn nhất khi rời cột nhưng lại hẹp nhất trong cột. Điều này là do dải xanh di chuyển qua các vật liệu nhồi chậm nhất và cần nhiều thời gian cũng như lượng pha động để rửa giải hoàn toàn. Lượng pha động chảy với tốc độ không đổi làm cho dải màu xanh bị pha loãng nhiều hơn. Vì tín hiệu từ đầu dò tỷ lệ với nồng độ chất nên dải màu xanh tuy thấp hơn nhưng lại có bề rộng lớn hơn.