Định tính và định lượng hợp chất

Trong hình H, các hợp chất phẩm màu xuất hiện dưới dạng 3 peak theo thời gian trên sắc ký đồ. Mỗi phân đoạn rửa giải tại một vị trí riêng, đo bằng thời gian từ lúc bắt đầu tiêm mẫu (t = 0) và thời gian đỉnh peak xuất hiện cao nhất. Bằng việc so sánh thời gian lưu với chất chuẩn đối chiếu với cùng điều kiện (cùng pha tĩnh và pha động), người phân tích có thể xác định từng hợp chất.

Hình I-1: Định tính

Trong sắc ký đồ ở hình I-1, người phân tích biết rằng, dưới điều kiện phân tích đang sử dụng, chất phân tích, ở đây là acrylamide, sẽ được tách và rửa giải ở thời gian lưu t = 2,85 phút. Mẫu mới, trong mẫu có chứa acrylamide, được tiêm vào hệ thống LC với cùng điều kiện, sẽ có một peak xuất hiện tại t = 2,85 phút (mẫu B ở hình I-2).

Khi đã định tính xong, một thông tin vô cùng quan trọng khác là trong mẫu có bao nhiêu chất đó. Sắc ký đồ và các dữ liệu liên quan sẽ giúp chúng ta tính toán được nồng độ từng chất. Đầu dò sẽ ra tín hiệu dựa trên nồng độ chất đi qua flow cell. Nồng độ càng cao, tín hiệu càng mạnh, cụ thể hơn là ở chiều cao peak so với đường nền.

Hình I-2: Định tính và định lượng

Ở hình I-2, sắc ký đồ mẫu A và B được chỉnh về cùng độ chia trục thời gian. Lượng mẫu tiêm là như nhau với cả hai lần tiêm. Cả hai sắc ký đồ đều cho peak tại thời gian t = 2,85 phút, chứng tỏ mỗi mẫu đều có acrylamide. Tuy nhiên, mẫu A cho peak lớn hơn với acrylamide. Diện tích peak là đại lượng dùng để tính nồng độ chất trong mẫu. Giá trị diện tích này được tính trực tiếp trên máy tính. Trong ví dụ này, peak của acrylamide trong mẫu A có diện tích gấp 10 lần mẫu B. Sử dụng chuẩn đối chiếu, xác định được rằng acrylamide trong mẫu A là 10 pg, gấp 10 lần trong mẫu B (1 pg). Để ý rằng có một peak khác được rửa giải tại t = 1.8 phút ở cả hai mẫu. Vì diện tích peak ở cả hai mẫu là như nhau, chất chưa biết có thể có cùng nồng độ ở cả hai mẫu.

Chế độ rửa giải đẳng dòng và gradient

Có hai kiểu rửa giải chính trong HPLC. Kiểu đầu tiên là rửa giải đẳng dòng. Trong chế độ này, pha động, có thể là dung môi tinh khiết hoặc hỗn hợp dung môi, sẽ được di chuyển với thành phần không đổi trong quá trình chạy. Sơ đồ chung của hệ thống thể hiện ở hình J-1.

Hình J-1: Hệ thống LC đẳng dòng

Kiểu thứ hai là rửa giải theo gradient, đúng như tên gọi của nó, pha động sẽ thay đổi thành phần trong quá trình phân tách. Chế độ này phù hợp với những mẫu chứa nhiều hợp chất có độ phân cực trải rộng. Trong quá trình phân tách, cường độ rửa giải sẽ tăng để rửa giải những chất bị lưu giữ mạnh hơn.

Hình J-2: Hệ thống gradient cao áp

Trong trường hợp đơn giản nhất ở hình J-2, có hai lọ và hai bơm. Tốc độ của hai bơm được kiểm soát bởi bộ điều khiển gradient để cấp thêm hay bớt từng dung môi trong quá trình phân tách, Hai dòng sau đó sẽ được trộn để tạo thành pha động và đi qua hệ thống. Lúc đầu, pha động chứa nhiều dung môi yếu (dung môi A) hơn. Theo thời gian, tỷ lệ dung môi B sẽ tăng dần theo chương trình định trước. Ở hình J-2, bộ trộn sau bơm, vì vậy quá trình trộn dung môi diễn ra dưới áp suất cao. Các hệ thống HPLC khác được thiết kế để trộn dung môi dưới áp suất thấp, trước bơm. Van chọn sẽ lấy từ bốn lọ dung môi, thay đổi cường độ pha động theo thời gian (hình J-3).

Hình J-3: Hệ thống gradient hạ áp

Các kiểu HPLC (Phân tích, Điều chế và Công nghiệp)

Chúng ta đã nói về HPLC cung cấp dữ liệu phân tích để phân tích định tính cũng như định lượng các chất có trong mẫu. Tuy nhiên, HPLC có thể được sử dụng để tinh chế và thu lượng chất theo nhu cầu, sử dụng bộ gom phân đoạn của flow cell. Quá trình này gọi là sắc ký điều chế (hình K).

Trong sắc ký điều chế, các nhà khoa học có thể thu từng chất phân tích riêng biệt khi chúng được rửa giải khỏi cột (trong ví dụ này là dải vàng, đỏ và xanh).

Hình K. Hệ thống HPLC cho việc tinh chế: Sắc ký điều chế

Các bình gom thu các phân đoạn rửa giải dưới dạng chất phân tích tinh khiết, trong một khoảng thời gian, chỉ thu một chất duy nhất.

Các nhà khoa học xác định yêu cầu về mức độ tinh khiết và lượng chất cần thiết. Cùng với sự hiểu biết về sự phức tạp của mẫu và các dạng chất và lượng chất cần thiết so với thành phần nền, lượng mẫu cần thiết và kích thước cần được xác định. Nói chung, khi lượng mẫu tăng, kích thước cột sẽ tăng và bơm sẽ cần tạo tốc độ dòng lớn hơn. Xác định dung lượng hệ thống HPLC được gọi là xác định loại hình HPLC. Bảng A gồm các loại HPLC và mục đích của nó.

Bảng A: Các loại sắc ký lỏng

Khả năng tối đa hóa độ chọn lọc với sự kết hợp giữa pha tĩnh và pha động cụ thể – đạt được khả năng phân tách lớn nhất có thể giữa hai thành phần quan tâm có trong mẫu – rất quan trọng khi xác định kiểu sắc ký phù hợp: từ thể tích cột đến lượng mẫu tiêm, kích thước hạt, độ dài lớp chất nhồi và đường kính trong, lượng chất nhồi có thể chứa trong cột (hình L).

Hình L: Các kích thước cột HPLC

Cột HPLC có chiều dài dao động từ 20 mm đến 500 mm và đường kính trong dao động từ 1 mm đến 100 mm. Khi kích thước cột tăng, tiết diện cũng sẽ tăng. Để tối ưu hóa lượng chất đi qua, tốc độ dòng pha động phải tăng tỷ lệ với diện tích tiết diện. Nếu hạt nhồi nhỏ hơn được ưu tiên sử dụng cho hiệu quả tách tốt hơn, bơm phải được thiết kế để có tốc độ dòng lớn hơn ở áp suất ngược lớn. Bảng B là hướng dẫn lựa chọn kích thước cột phù hợp với từng mục đích.

Bảng B: Kích thước cột theo mục đích sử dụng