Phần cứng của cột HPLC

Cột dạng ống và các phụ kiện đi kèm phải chứa vật liệu nhồi sắc ký (pha tĩnh) được sử dụng để tăng hiệu quả phân tách. Nó phải chịu được áp suất ngược tạo ra trong quá trình sản xuất cũng như trong quá trình sử dụng. Đồng thời, nó phải cung cấp khả năng điều khiển dòng chảy (không bị rò rỉ, thể tích tối thiểu và thể tích chết) cho mẫu ở đầu vào cột, và các dải chất phân tích ở đầu ra cột, và phải trơ với các thành phần của hệ phân tách (mẫu, pha tĩnh và pha động). Phần lớn các cột được làm từ thép không gỉ, chịu được áp suất rất cao. PEEK^TM và thủy tinh, vốn chịu áp suất thấp hơn, có thể được sử dụng khi bề mặt trơ là cần thiết trong các ứng dụng hóa học và sinh học đặc biệt (hình M-1).

Hình M-1: Một số ví dụ về vỏ cột

Cột thủy tinh cung cấp khả năng quan sát bên trong cột. Ở hình M-2, dòng pha động đã được dừng chảy trong khi các dải mẫu vẫn ở trong cột. Có thể thấy ba dải màu trong mẫu đã được tách; dải màu vàng, di chuyển nhanh nhất, chuẩn bị rời cột.

Hình M-2: Cấu tạo bên trong cột

Hiệu năng phân tách – Độ phân giải

Thông số dùng để đánh giá độ phân tách gọi là độ phân giải sắc ký. Hai yếu tố chính để đánh giá hiệu lực phân tách hay độ phân giải là: hiệu lực cột, quyết định bởi chiều dài cột, kích thước hạt và độ đồng nhất của hạt nhồi, và khả năng phân tách hóa học, tạo ra bởi các cạnh tranh tương tác vật lý cũng như hóa học với hợp chất giữa hạt nhồi và pha động. Hiệu lực cột là thông số để xem xét về khả năng phân tách cơ học, trong khi độ chọn lọc là thông số để xem xét về khả năng phân tách hóa học.

Khả năng phân tách cơ học – Hiệu lực cột

Nếu lớp chất ổn định và được nhồi đồng nhất, khả năng tách cơ học được quyết định bởi độ dài cột và kích thước hạt. Khả năng tách cơ học, còn gọi là hiệu lực cột, thường được tính và so sánh bằng số đĩa lý thuyết N. Hạt nhỏ sẽ có hiệu lực lớn hơn và chịu được áp suất ngược lớn hơn. Với kích thước hạt cố định, khả năng tách cơ học sẽ lớn hơn bằng cách tăng chiều dài cột. Tuy nhiên, điều này sẽ khiến thời gian sắc ký trở nên dài hơn, tốn nhiều dung môi hơn và làm tăng áp suất ngược. Cột ngắn hơn sẽ giúp giảm các thông số trên nhưng lại làm giảm khả năng tách cơ học (hình N).

Hình N: Độ dài cột và khả năng tách cơ học (cùng kích thước hạt)

Hình O: Kích thước hạt và khả năng tách cơ học (cùng chiều dài cột)

Với cùng loại hạt, pha động và tốc động, như trên hình O, cột có cùng chiều dài và đường kính trong, nhưng với hạt nhỏ hơn sẽ giúp khả năng tách cơ học lớn hơn tại cùng thời điểm. Tuy nhiên, khi đó, áp suất ngược sẽ lớn hơn.

Khả năng phân tách hóa học – Độ chọn lọc

Sự lựa chọn pha tĩnh và pha động – hệ tách – sẽ quyết định mức độ phân tách hóa học (thay đổi tốc độ của từng chất phân tích). Độ chọn lọc tối ưu là thông số quan trọng trong quá trình tách, điều này giúp loại bỏ việc phải sử dụng áp suất cực cao để đạt sự tách cơ học tốt nhất có thể. Để tách hai chất cụ thể, các nhà khoa sẽ sẽ chọn nhiều cặp pha khác nhau (pha tĩnh và pha động) và cơ chế lưu giữ (kiểu sắc ký).