Điểm nổi bật:

Phân tích đồng thời hàm lượng vitamin A và vitamin D trong hỗn hợp và nồng độ cao.

Đơn giản quá trình chuẩn bị mẫu – Không cần tinh sạch hay pha loãng mẫu.

Tiêm mẫu trực tiếp – không cần chiết mẫu – tạo điều kiện thuận lợi trong việc phát hiện vitamin D3 không cần làm giàu mẫu.

Sử dụng một lượng dung môi rất ít thải ra môi trường để thực hiện quá trình sắc ký.

Giới thiệu:

Phân tích đồng thời các vitamin tan trong dầu trong thực phẩm là một việc rất khó khăn bởi chúng rất khác nhau về đặc tính và nồng độ. Một loại phương pháp phân tích là chiết xuất ra dung môi và thực hiện phản ứng xà phòng hóa sau đó được phân tích với sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò UV/Vis. Sau quá trình xà phòng hóa dịch chiết có thể được phân tích trực tiếp đối với trường hợp vitamin A, nhưng chúng được pha loãng để phân tích bởi hàm lượng vitamin A trong thực phẩm rất cao và khối lượng phân tử của chúng rất lớn. Thật không may, sự pha loãng mẫu không phải là một giải pháp tối ưu trong trường hợp này. Để đo lường hàm lượng vitamin D3, dịch chiết được làm sạch một cách sơ bộ bằng phươn pháp sắc  ký và làm giàu mẫu. Đối với nhưng yêu cầu về Vitamin A và D3 rất tách rời nhau, đưa đến việc khó khăn trong phương pháp phân tích. Thực hiện phân tích bằng sắc ký lỏng những thành phần này thì rất dài, độ ổn định thấp, độ thu hồi kém. Như quá trình chiết và xà phòng hóa Vitamin A và phươn pháp đối với vitamin D3 một ví dụ điển hình. Qua đó chúng tôi nghiên cứu và điều tra có thể thực hiện phương pháp sắc ký hội tụ để phân tích đồng thời hàm lượng vitamin A và Vitamin D3 chỉ trong một phương pháp phân tích sắc ký đơn thuần.

UPC2 là một kỹ thuật tách mà sử dụng CO2 nén làm pha động chính, nó tạo điều kiện thuận lợi cho cột sắc ký với pha tĩnh là 2 μm, độ nhớt thấp của CO2 là một điều kiện thuận lợi cho hệ thống sắc ký. Khác với hệ thống sắc ký truyền thống và tối ưu độ nhạy cho quá trình định lượng. UPC2 ngoài ra còn sự dụng ít dung môi thải khi so sánh với hệ thống sắc ký lỏng truyền thống. Trong ứng dụng này, chúng tôi muốn báo cáo một phương pháp phân tích hàm lượng Vitamin A và D3 trong hỗn hợp có nồng độ cao với chỉ một phân tích đơn giản mà không cần quá trình làm sạch và làm giàu mẫu. Đặc tinh đo lường của UPC2 và thuận lợi của phương pháp này so với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao truyên thống.

Tiến hành phân tích:

UPC2 conditions
System:	ACQUITY UPC2
Detector:	PDA
Software:	Empower 3
Column:	ACQUITY UPC2  3.0 mm x 100 mm, 1.7 μm
Mobile phase A:	Compressed CO2
Mobile phase B:	isopropanol
Wash solvent:	Methanol
Flow rate:	1.7 mL/min
APBR:	2,000 psi
Column temp.:	55 °C
Injection volume:	7.0 μL
Detection:	UV 260 nm
Gradient:	0.5% to 20% B in 9.9 min Hold at 20% for 2 min, re-equilibrate for 3 min

Quá trình chuẩn bị mẫu:

Cân 1.5 gam mẫu Vitamin thô và thêm vào 1ml dung dịch chuẩn Vitamin D2 (dùng làm nội chuẩn) tất cả cho vào bình tam giác 250ml. Thêm 50ml ethanol, 10ml dun dịch KOH 50% và 2ml Natri ascorbate 33%. Mẫu được xà phòng hóa trong thời gian 1 giờ ở 80 – 85 ^oC trong bể cách thủy nhiệt độ. Sau khi quá trình xà phòng hóa hoàn thành, mẫu được làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và mẫu được chiết trong hỗn hợp diethyl ether và n-hexan. Dịch chiết được rửa với nước de-izon để loại dung dịch kiềm và làm đầy tới 50ml với dung dịch n-hexan. Dung dịch được lọc qua màng lọc 0.20.2 μm để phân tích với hệ thống UPC2/PDA.

Mô tả mẫu:

Retinyl acetate (Vitamin A dạng acetate) được cung cấp từ Sigma-Aldrich, cholecalciferol (vitamin D3) và ergocalciferol (vitamin D2) được cung cấp từ dược điển USP. Hỗn hợp vitamin được lấy từ DSM Nutritional Product, Swizerland. Hình 1. Cấu trúc của các thành phần liên quan trong quá trình nghiên cứu.

 

Hình 1. Cấu trúc của retinyl acetate, retinol, cholecalciferol, and ergocalciferol

Kết quả và thảo luận:

Do sự hấp thu của vitamin D3 là rất thấp và nồng độ của chúng trong mẫu thử là thấp hơn vitamimin A mười lần, do đó cả 2 Vitamin A và Vitamin D3 được định lượng ở bước sóng hấp thu cực đại của Vitamin D3. Phổ đồ thu được cho thấy bước sóng hấp thu cực đại của vitamin D3 là 260nm được hiển thi trong hình 2. Sắc ký đồ chiết ra bước sóng được hiển thị trong hình 3.

Hình 2. Sắc ký đồ của dung dịch vitamin chuẩn ở bước sóng 260nm

Hình 3. Sắc ký đồ đỗi với mẫu thử được chiết ra ở bước sóng 260nm.

Đường tuyến tính của quá trình định lượng được khảo sát và sử dụng dung dịch chuẩn. Diện tích peak trung bình của 3 mũi tiêm lặp lại ở 7 nồng độ được sử dụng. Vitamin D2 được sử dụng để làm chất nội chuẩn cho quá trình định lượng hàm lượng Vitamin D3, nhưng quá trình định lượng vitamin A không có sử dụng nội chuẩn. Hệ số tương quan R2 đối với phương trình hồi qui tuyến tính của vitamin A và vitamin D3 là 0.9998 và 1.0000. Độ chính xác trung gian và độ thu hồi của quá trình định lượng trong thời gian 3 tháng được thể hiện trong bảng 1. Độ chính xác trung gian của vitamin A là 5.1% và 5.7% đối với vitamin D3, cả 2 đều rất tốt phù hợp với yêu cầu là nhỏ hơn 8%.

Analyte	Độ chính xác trung gian (%)	Yêu cầu (%)	Khoảng nồng độ UI/g
Vitamin A	5.1	<8	38.000 – 55.800
Vitamin D3	5.7	<8	2.280 – 4.230

Bảng 1. Thuộc tính đo lường của phương pháp được thẩm tra trong 3 tháng

Để đánh giá độ tin cậy, độ thay đổi được thực hiện ở tốc độ dòng, áp suất hiện thống và nhiệt độ cột phân tích được theo dõi ảnh hưởng đến kết quả của quá trình phân tích. Không có sự khác biệt lớn đối với ý nghĩa thống kê với độ lệch là 2% trên kết quả, và độ phân giải sắc ký của vitamin D2 và D3 là lớn hơn 1.6 (trong khi yêu cầu là R>1.2).

Việc sử dụng sắc ký lỏng siêu tới hạn sử dụng CO2 ết hợp với cột sắc ký có hạt nhồi là 2-μm cung cấp nanh và đáng tin cậy kết quả phân tích hàm lượng Vitamin A và Vitamin D3 chỉ sử dụng một phân tích duy nhất với khoảng nồng độ độ có sự khác biệt lớn. Độ chọn lọc tuyệt vời của hệ thống UPC2 cung cấp đường nền của quá trình phân tách dẫn đến độ tinh khiết của peak rất lớn phù hợp để phân tích các đồng phân cis- hay trans- của các retinols và nhón các vitamin D ở bước sóng 260nm trong cùng một phân tích. Vitamin D3 và vitamin D2 (dung dịch nội chuẩn) được tách ra với mỗi phân tích. Việc chiết xuất trong dung dịch n-hexans có thể được tiêm ngay trực tiếp vào hệ thống mà không phải tốn nhiều dung môi cho nhiều bước chuẩn bị phức tạp trong phòng thí nghiệm.

Kết luận:

Phương pháp định lượng đơn giản và tiết kiệm chi phí để phân tích hàm lượng vitamin A và vitamin D3 trong hỗn hợp nhiều vitamin khác nhau, sử dụng hệ thống UPC2 được phát triển và thẩm tra. Phương pháp thực hiện với hệ thống UPC2/PDA cho kết quả với đường tuyến tính, hệ số phân giải, và độ lặp lại rất tốt. Độ chính xác trung gian của phương pháp được tính toán trong thời gian 3 tháng nhỏ hơn 6%. Về mặt thông số thì hệ thống UPC2 giảm thiểu rất nhiều việc tiêu thụ dung môi so với phương pháp HPLC. Bên cạnh CO2, chỉ có dung môi được yêu cầu là Isopropanol. Việc tiêu thụ isopropanol là 0.12ml/test. Việc giảm thiểu lượng dung môi tiêu thụ so với phương pháp HPLC là cũng như giảm lượng dung môi thải. Bằng một qui trình đơn giản và giảm thiểu nhiều thao tác phức tạp trong phòng thí nghiệm, giảm thiều dung môi tiêu thụ làm tăng hiệu quả của quá trình hoạt động và góp phần bảo vệ môi trường.

Tài liệu tham khảo.

1. Aubin A, Analysis of Fat Soluble Vitamin Capsules using UltraPerformance Convergence Chromatograqphy UPC.2 Waters Application Note No. 720004394EN (2012).
2. Standard Method Performance Requirements for Vitamin A in Pre-Blends, Pre-Mixes, and Pure Materials – AOAC SMPR 2012.003.
3. Standard Method Performance Requirements for Vitamin D3 in Pre-Blends, Pre-Mixes, and Pure Materials – AOAC SMPR 2012.004.